1樓：死地而後生
洗滌緩衝液一般為含 tween20的中性pbs（即pbst），tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機理是，藉助其疏水基團與經疏水性相互作用被動吸附於聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結合作用下，促使蛋白質脫離固相而進入液相，這樣就可達到去掉非特異吸附物的目的。
求助elisa抗體稀釋的問題
2樓：義翹神州加油
抗體稀釋可以用廠家推薦濃度為基礎，而後進行上下梯度設計。從而獲得最佳條件。
3樓：緒經學意致
沒有專門的含穩定劑的稀釋液，稀釋後的抗體很不穩定，最好是現配現用。就算儲存也不要在4度放一週。
如果不小心一次稀釋多了，而一下子沒法用完。可以分裝後凍起來，一次取一支用。這樣凍融一次問題也不大。
請教，elisa中的棋盤滴定法，謝謝，急用
4樓：elisa愛逛街
在建立某一elisa測定中，應對包被抗原或抗體的濃度和酶標抗原或抗體的濃度予以選擇，以達到最合適的測定條件和節省測定費用。下面以間接法測抗體和夾心法測抗原為例，介紹最適工作濃度的選擇方法。
一）間接法測抗體。
1．酶標抗抗體工作濃度的選擇。
1）用100ng/ml人igg進行包被，洗滌。
2）將酶標抗人igg用稀釋液作一系列稀釋後分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。
3）加底物顯色。加酸終止反應後，讀取吸光度（a）。讀取a值在時的酶標抗體稀釋度，作為酶標抗體的工作濃度。該酶標抗人igg的工作濃度應為1/1600。
2．棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度。
1）用包被液將抗原作一系列稀釋後進行包被，洗滌。
2）將強陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋，加樣，保溫，洗滌。
3）加按工作濃度稀釋的酶標抗人igg抗體，保溫，洗滌。
4）加底物顯色。加酸終止反應後讀取a值。
5）選擇強陽性參考血清的a值為左右、陰性參考血清的a值小於的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。
二）夾心法測抗原。
在夾心法elisa法中可用棋盤滴定法同時選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度，舉例如下：
表 夾心elisa包被抗體和酶標抗體工作濃度的選擇。
1）抗體免疫球蛋白用包被緩衝液稀釋至蛋白濃度為和，分別在elisa板上進行包被，每一濃度包括三個縱行，洗滌。
2）在乙個橫行各包被孔中加入強陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對照液，保溫，洗滌。
3）將酶標抗體用稀釋液稀釋成三個濃度，例如:5000和1:25000。分別加入每一包被濃度的乙個縱行中，保溫，洗滌。
4）加底物顯色。加酸終止反應後，讀取a值。
5）以強陽性抗原的a值在左右、陰性參考的a值小於的條件作最適條件，據此選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度。從表中可看出包被抗體濃度可選用1μg/ml，酶標抗體的稀釋度可選為1:5000。
為了進一步節省試劑，可以此濃度為基點，縮小間距再做進一步的棋盤滴定。
bim試劑盒為您提供！
5樓：南京金益柏
這是我做雙抗體夾心elisa時設計的方案，你可以參考一下。
棋盤滴定法選擇抗體的最適工作濃度。
a) 用包被緩衝液稀釋單轉殖抗體，濃度分別為10ug/ml、, 包被酶標板，每一濃度包被三個縱行，每孔100ul，每孔均作復孔。4 ℃過夜，pbst洗滌3次；
b) 5%脫脂奶粉封閉酶標板， 37℃孵育1h，洗滌3次；
c) 在橫行包被孔中依次加入空白對照，陰性對照血清，弱陽性抗原液及強陽性抗原液，各100ul,37℃孵育1h，洗滌3次；
d) 在每一包被濃度的乙個縱行中分別加入按：10000 稀釋的多抗， 37℃孵育1h，洗滌3次；
e) 在每一包被濃度的乙個縱行中分別加入hrp標記igg抗體，稀釋度先按說明書上的，37℃孵育1h，洗滌3次；
f) 加tmb底物，37℃避光顯色10-15min，用2mol/l h2so4終止反應，酶標儀450nm讀取吸光度（od）值；
g) 測得的強陽性抗原液od值在左右，陰性對照od值小於的組合為較理想的組合。
可根據初步確定的濃度縮小間距，再做進一步棋盤滴定，尋找最佳包被條件。
抗體做稀釋時最好用同乙個原始濃度做倍比稀釋，這樣可以儘量減少由於加樣槍造成的誤差及人為誤差。
連續做了兩邊elisa，為什麼會不顯色
6樓：南京金益柏
可能包被出現問題，可以包下抗原試試 或者將一抗生物素化，包親和素，再加生物素化一抗 抗原 二抗。
7樓：匿名使用者
只能這樣解釋了：採用間接elisa檢測抗血清效。
用ph , 的碳酸鹽緩衝液將純化的重組蛋白稀釋為、 1 , 包被酶標板， 每孔100μl, 4℃包被過夜。次日每孔加入100μl 7%的山羊血清封閉液， 37℃封閉2h後， 用pbst洗滌3次。然後每孔加入倍稀釋的羊抗血清100μl, 空白對照為兔抗血清稀釋液( bsa+pbs) ,37℃孵育1 h後， 同上洗滌3次。
再次每孔加入100μl hrp標記的羊抗人igg, 37℃孵育30 min後， 同上洗滌3次。接下來每孔加入100μl tmb顯色液， 37℃避光反應15 min後， 每孔再加入50μl 硫酸終止液。最後， 在酶標儀上測450 nm下的od值。
底物的ph值偏高，加入酸後，剛好中和到酶的最適ph值，所以酶開始發揮作用，分解底物顯色。
你的酸如果多加點，估計還是不會顯色的。
western blot中，封閉液封閉完成後，需要用pbs或pbst洗滌濾膜，然後進行一抗孵育
8樓：網友
封閉完可直接一抗孵育 一抗完了用pbst洗三次後二抗孵育 離子濃度肯定會對抗體結合有影響啦。
9樓：網友
就是洗疊氮鈉和非特異結合的一抗的，磷酸鹽只是緩衝環境，當然有人不喜歡用pbst洗，有人用tbst洗，就是乙個磷酸鹽緩衝環境和tris的緩衝環境而已，個人喜好。
10樓：網友
一抗孵育完成後洗膜是為了洗掉未和膜結合的抗體，而不是磷酸鹽。只有洗乾淨非特異性結合在膜上的一抗，加二抗時才不會因非特異結合而呈現很重的背景。至於是使用pbs(t)還是tbs(t)，這要具體看你的二抗種類。
pbs不適合ap系列，pbs/tbss適合ap和hrp體系。另外，做磷酸化蛋白的wb,pbs不合適。
11樓：天箭
一抗孵育完了要用pbst或tbst洗掉未結合抗原的一抗，一抗不洗乾淨顯色以後背景會很重。
12樓：百浩生物
有可能你看錯了，就一般的理解，是沒有必要的，tbst並不是洗磷酸鹽。或者二抗是ap標記的才要洗磷酸鹽。
hrp標記的二抗，就算是用pbst洗，也是可以的。因為二抗可以用pbs稀釋。洗去pbs是沒有意義的。
elisa實驗注意事項
13樓：罐頭妖妖
反應溫度在37度。
操作時應注意加樣不要加到孔壁上 儘量加到孔底部。
用pbst洗的時候要注意甩幹酶標板 然後在吸水紙上拍板。
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