請問高手我要用細胞做WesterBlot，請問詳細的步驟

1樓：網友

酶免疫測定是將抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合，發展建立的一種非放射性標記免疫分析方法。由於elisa具有靈敏度高、特異性強，酶免疫試劑的性質比較穩定，操作方法簡便快速、無放射性汙染以及應用範圍廣等很多優點，在醫學基礎理論研究，臨床病毒學和生物化學檢驗等工作中應用十分廣泛。

該法需將純化的抗原包被在固相載體，與一定稀釋度的待側血清反應，然後與酶標記的第二抗體（抗人igg,iga,igm或抗人的混合物）反應，酶可催化。

色原反應，在酶標測定儀一定波長下進行比色，測定吸光度。

elisa試劑盒的關鍵是要具備高質量純化或重組的抗原，對生產廠家的抗原要求很高。由於純化的或重組的抗原越來越多，以及商品化的高質量的elisa試劑盒的面市，它應用於臨床免疫實驗室的自身抗體的檢測已日漸。

增多，該法檢測自身抗體快速、敏感及特異性高。

免疫螢光法---自身抗體診斷的標準技術(ifa)免疫螢光測定法可分為直接和間接兩類，在自身抗體檢測中，以間接免疫螢光法最為常用。由於自身抗原的位置決定了其相應的抗體的典型螢光模式，該法能通過顯微鏡觀測精確地判斷組織或細胞內螢光的分佈。

將已稀釋血清與實驗基質進行溫育，令特異性抗體與實驗基質中相應抗原結合，然後再與螢光標記的第二抗體溫育，最後在螢光顯微鏡下觀察相應部位的特異性螢光模式。

此方法敏感、重複性好。但需要一臺質量較好的螢光顯微鏡，且對操作人員要較高，操作複雜耗時長，繁瑣。

免疫印跡法（immunoblot assay）（westerblot）

此法是將聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白及多肽與免疫反應的高特異性相結合的一項技術。蛋白質在電泳中依分子量大小分離，然後將分離好的蛋白轉印到硝酸纖維薄膜上，用酶標記的抗體或蛋白a進行染色。

該法簡單、快速。是目前美國、中國等國際上眾多國家衛生機構的最終確認方法。但其製備方法繁瑣、成本相對較高。