1樓:he11111yy微鑫
細胞免疫熒光的詳細du操作步zhi驟
1,取出細胞爬片放到35mm或60mm用過dao的細胞內培養皿裡,pbs洗三遍。注意容有的時候作的細胞爬片可能比較小,因此夾取的時候要小心。
2,4%多聚甲醛固定20分鐘,pbs洗三遍。
3,0.2%triton x 100通透10分鐘,pbs洗三遍。
4, 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,pbs洗三遍。
5.,一抗4度溼盒內過夜,也可37度2小時,感覺前者效果好,pbs洗三遍。
6,二抗室溫2小時,或者37度1半小時,pbs洗三遍。
7,最好用dapi染核,然後直接照熒光片。
8,蒸餾水洗掉pbs,甘油封片,指甲油封**的四周。
細胞免疫熒光,求助
2樓:匿名使用者
免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗結合,其次是帶有熒光基團的二抗識別並結合一抗,熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。實驗步驟如下:1、已轉染72h的細胞種於共聚焦專用培養皿裡,冰pbs洗三遍,每次5分鐘。
2、細胞半乾時,覆蓋以4%冷的多聚甲醛固定15分鐘,避光。3、吸去多聚甲醛後,用冰pbs洗三遍,每次5分鐘。4、0.
5%tritonx-100覆蓋細胞10分鐘,冰pbs洗三遍,每次5分鐘。5、與二抗相同宿主的血清?進口胎牛血清室溫封閉30分鐘。
6、配製一抗(sab2104246-50ug,sigma,usa):sab+fbs=1:200。
7、加入一抗覆蓋細胞,錫紙包裹4度避光過夜。次日:8、取出細胞復溫至室溫約1h。
9、冰1‰tween洗兩次,每次5分鐘,於搖床。冰pbs洗一次,5分鐘,於搖床。10、配製熒游標記二抗:
用pbs或fbs配製。濃度1:20011、加入二抗,室溫孵育1小時(避光)。
12、冰1‰tween洗兩次,每次5分鐘,於搖床。冰pbs洗一次,5分鐘,於搖床。13、dapi染核,每皿1滴,完全覆蓋住細胞即可。
14、冰1‰tween洗兩次,每次5分鐘,於搖床。冰pbs洗一次,5分鐘,於搖床。15、加入防熒光淬滅封片劑,避光。
16、上機confocol建議:1.還是染完之後沒有封片前直接照一些,因為有的時候可能封片會出現問題,再想照反而沒有了,另外不要拖太長時間,熒光會淬滅的。
2.熒光的**一定要避光儲存,儲存的好的話,過一段時間仍然能照出很好的**。3.
二抗用之前一定離心,不然有的時候有那種沉澱,在**上就是一個很大的非特異性熒光光點,非常難看。4.不管採用何種方法,在使用pbs緩衝液漂洗時,如果結果背景較高可以延長漂洗的次數和時間。
求助 細胞免疫熒光的詳細操作步驟
3樓:匿名使用者
1,取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養皿裡,pbs洗三遍。注意有的時候作的細胞爬片可能比較小,因此夾取的時候要小心。
2,4%多聚甲醛固定20分鐘,pbs洗三遍。
3,0.2%triton x 100通透10分鐘,pbs洗三遍。
4, 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,pbs洗三遍。
5.,一抗4度溼盒內過夜,也可37度2小時,感覺前者效果好,pbs洗三遍。
6,二抗室溫2小時,或者37度1半小時,pbs洗三遍。
7,最好用dapi染核,然後直接照熒光片。
8,蒸餾水洗掉pbs,甘油封片,指甲油封**的四周。
求助:細胞免疫熒光檢測病毒是否能夠定量?
4樓:而成哦
要看陽性對照和陰抄性對照,陰性對照沒有熒光,陽性對照有熒光,重複一次結果穩定的話就可以說是陽性了。樣品的稀釋度要看蛋白的表達量,用你們實驗室的標準protocol先做一遍,結果不好再優化條件。定量是可以的,要做western blot和elisa,但也只是相對定量,不是絕對定量,把你檢測的結果儲存一張比較好的**,背景清晰,結果穩定的。
用影象軟體處理,把你空白對照組所出現的結果明暗度設定為1,在比較實驗組的結果,得出的百分比就是半定量的結果。
細胞免疫熒光,求助
5樓:南京金益柏生物科技****
細胞爬片免疫熒光實驗步驟
第一天:
1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用pbs浸洗3次,每次3min;
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, pbs浸洗玻片3次,每次3min;
3. 0.5%triton x-100( pbs配製 )室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);
4. pbs浸洗玻片3次,每次3 min,吸水紙吸乾pbs,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min;
5. 吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗並放入溼盒,4°C孵育過夜;
第二天:
6. 加熒光二抗: pbst 浸洗爬片3次,每次3min,吸水紙吸乾爬片上多餘液體後滴加稀釋好的熒光二抗,溼盒中20-37°C孵育1h,pbst浸洗切片3次,每次3min;
注意:從加熒光二抗起,後面所有操作步驟都儘量在較暗處進行。
7. 復染核:滴加dapi避光孵育5min,對標本進行染核,pbst 5min×4次洗去多餘的dapi;
8. 用吸水紙吸乾爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然後在熒光顯微鏡下觀察採集影象。
細胞免疫熒光的幾個問題
6樓:匿名使用者
要看陽性復對照和陰性制對照,陰性對照沒有熒光,陽性對照有熒光,重複一次結果穩定的話就可以說是陽性了。樣品的稀釋度要看蛋白的表達量,用你們實驗室的標準protocol先做一遍,結果不好再優化條件。定量是可以的,要做westernblot和elisa,但也只是相對定量,不是絕對定量,把你檢測的結果儲存一張比較好的**,背景清晰,結果穩定的。
用影象軟體處理,把你空白對照組所出現的結果明暗度設定為1,在比較實驗組的結果,得出的百分比就是半定量的結果。
關於細胞免疫熒光染色的問題
7樓:匿名使用者
(1)你的二抗是用fitc標記的,為避免熒光分解,分裝及熒光顯微鏡觀察時均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/l ph9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液,後者能使玻片透明;
(3)關於免疫酶染色,如果是用過氧化物酶做標記,就必須用3%h2o2以去除內源性過氧化物酶;2n鹽酸需要使用,目的是使dna變性,讓brdu抗體能夠充分地與已經摻入的brdu結合。
做間接法免疫熒光染色,如何設定對照?
參考見解:最好是同一視野在未用熒光激發下進行對照,看是否非特異性染色。
(1)空白對照:如果你做的是石蠟切片免疫組化,這個對照必須有,目的是看自發熒光,脫蠟後直接在熒光顯微鏡下觀察。
(2)陰性對照:標本直接滴加二抗,呈陰性反應。
(3)抗原對照:標本加同種動物的未免疫血清,以pbs沖洗後,在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體,應呈陰性反應。
細胞免疫熒光,求助,繼續求助免疫熒光檢測NF
細胞免疫熒光記得先上圖,要不我們也不知道如何幫你啊,對吧 細胞免疫熒光,求助 細胞爬片免疫熒光實驗步驟 第一天 1.在培養板中將已爬好細胞的玻片用pbs浸洗3次,每次3min 2.用4 的多聚甲醛固定爬片15min,pbs浸洗玻片3次,每次3min 3.0.5 triton x 100 pbs配製 ...
求助 細胞免疫熒光檢測病毒是否能夠定量
要看陽性對照和陰抄性對照，陰性對照沒有熒光，陽性對照有熒光，重複一次結果穩定的話就可以說是陽性了。樣品的稀釋度要看蛋白的表達量，用你們實驗室的標準protocol先做一遍，結果不好再優化條件。定量是可以的，要做western blot和elisa，但也只是相對定量，不是絕對定量，把你檢測的結果儲存一...
細胞固定不好以及免疫熒光背景強怎麼辦
補充 一抗用的abcam的,1 200稀釋 二抗用的國產的中杉金橋的,1 50稀釋的。細胞免疫熒光失敗原因求教,細胞免疫熒光 首先你應bai該確認老鼠是不是du轉基因老鼠,會不會有自zhi發熒光的產生 dao。其次,二專抗就是熒光染料,屬只要加了二抗,就會有熒光的產生,所以需要在加完二抗後用pbs洗...