轉基因為什麼不能直接用pcr產物連線在表達載體上?
1樓：法師藥材店
當然是可以直接將目標基因pcr後直接連到表達載體上的。但實際上在操作過程中，我們都是推薦先將目標基因的pcr產物連線到轉殖載體上後再用於構建表達載體。原因是首先如果是未知序列的話，需要用轉殖載體來對這段序列進行測定，然後好確定序列中的酶切位點，為下一步表達載體的構建策略提供必要的資訊。
然後，即使是序列很確定的基因，一般也會先裝在轉殖載體上。主要是因為你沒辦法保證你的序列的重複性。如果直接用pcr產物的話，由於你的模板並不一定是完全一致的，即使有少量的mrna有鹼基錯配，很有可能就在pcr反應中這些錯誤的mrna反轉錄的cdna就被無限放大了，這樣你連上去的序列就不一定準確了。
但如果是裝入轉殖載體的序列，從轉殖載體上獲得的序列就有絕對的一致性，這樣結果才有說服性。最後一點就是，連在轉殖載體上的片段是很穩定的，你以後進行實驗的時候還能保證可以獲得完全一致的片段。但如果重新rt-pcr，這結果就有幾率不同了。
當然，對於已知序列直接pcr產物連線表達載體是很少幾率出錯的，這樣做實際上是為了實驗結果的嚴謹。
2樓：網友
一是測序方便，有通用引物嘛~二是提高連線效率~
3樓：網友
酷似是為了測序方便，有時候表達載體不能進行測序，或者說不方便，就需要經過一次亞轉殖。當然，如果表達載體可以用通用引物測序就可以一步到位進行連線，測序證實沒有突變就可以去表達了。
請問從酶切後的溶液中如何**dna(不用切膠**的方法)**後的pcr產物是否適合於表達載體連線?
4樓：網友
可以啊，用乙醇沉澱**dna，然後直接加入到連線體系中，如果有陽性質粒在裡面，會表達的。
5樓：矽鍺
是可以的，我們實驗室就是這麼做的。
6樓：雲程萬里
你好，這位朋友。
你的問題我來給你。
據你的描述，顯然是不合適的。絕對不要使用。
基本上就是這麼多。
如果還有疑問，請繼續諮詢謝謝。
如何確保pcr產物以正確的方向轉殖到表達載體中 (未翻譯方向)
7樓：網友
完全確保的話，第一，做酶切的兩個酶要不一樣；二你在做完酶切後，用磷酸化酶處理下，純化後再連線（這一不會降低連線效率，但會確保質粒不自連。按正確方向轉殖。
8樓：xxd糰子
連線前：兩端的酶切位點的選擇，可以鎖定於載體中你需要的那一段；
連線後檢測：連線上之後，可以搖菌提質粒，根據你插入的那段序列前後的其他酶切位點，選擇一對或幾對酶，然後電泳檢測，如果插入的方向不一樣，切割下的片段的長度是不一樣的。
9樓：網友
設計pcr引物時在上下游引物5'端加上不一樣的酶切，pcr後通過雙酶切將pcr產物轉殖到表達載體上。
10樓：曠雁凡
酶切後pcr產物只能順著乙個方向連線，粘性末端互補的才會連到一起…
為什麼pcr擴增後不直接進入表達載體，而要經過轉殖載體呢？關鍵原因是什麼呢？謝謝
11樓：網友
這個問題的主要原因是pcr產物不容易被酶切。轉殖到t載體後就可以很容易的進行酶切。這樣做起方便。
12樓：網友
轉殖載體可以使目的基因在宿主中低成本便捷的擴增轉殖載體便於穩定儲存目的基因。
轉殖載體上有很多合適的酶切位點供選用。
轉殖載體提供驗證，如測序，的方法。
用高保真酶pcr，連到表達載體上還要不要加a
13樓：茅山0九叔
你得看用的什麼酶，有的高保真酶會帶a，可以直接at轉殖。有的則沒有，你就得另外加a了。具體說明書上都會註明的。
用pcdna3.1(+)作為表達載體，設計pcr引物時怎麼能保正不移碼？起始密碼子前的鹼基個數應該是多少？
14樓：網友
樓主是要以cdna為模板設計引物嗎？那樣的話不用考慮移碼的問題。因為cdna序列在起始密碼子之前的5『端是不會出現另乙個起始密碼子的。
15樓：網友
不會移碼的 只要pcr產物的起始密碼子前面沒有別的起始密碼子了。
16樓：網友
你都有起始密碼子了就不怕移碼了，除非你是融合基因才需要仔細考慮融合的地方會不會移碼。
能不能用pcr直接擴增目的片段，然後轉入表達載體，代替在轉殖載體或dh5a中的擴增
17樓：網友
可以，只要你的pcr擴增特異性夠強，沒有雜帶。這其實就是理論和實際的差距，因為表達載體的擴增效率低，如果一次實驗不成功，你還要從pcr步驟做起重新收集dna，而如果轉殖至擴增載體，每次只需擴增質粒**dna即可。
18樓：網友
可以的，但是效率不高，目的片段測序的時候也不能用通用引物了，會不太方便。
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